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      細菌RNA提取試劑盒(DNase I)操作說明書
      點擊次數:68 發布時間:2022-06-13

        

       

      細菌RNA提取試劑盒(DNase I)說明書

                                                                                                 

      RNApure Bacteria KitDNase I

      細菌RNA提取試劑盒(DNase I

       

      Cat. No.   K0539

      保存:DNase I、10×Reaction Buffer-20

      其它組分:室  

       

      組分說明

       

                                                    Cat. No.              k0539

                                                    Kit Size                 50

                                                    DNase I                1000 U

                                              10×Reaction Buffer           1000  μl

                                                   Buffer RL               35 ml

                                                  Buffer RW1               40 ml

                                          Buffer RW2concentrate)          11 ml

                                              RNase-Free Water             10 ml

                                            Shredder Spin column             50

                                               Spin Column RM               50

                                          Collection Tube1.5 ml)            50

                                           Collection Tube2 ml)            100

       

      產品簡介

       

          本試劑盒采用高效、專一結合核酸的離心吸附柱和獨特的緩沖系統,可從細菌或培養的動物細胞中快速提取總 RNA。30-40 分鐘內即可完成反應,提取的總 RNA 純度極高,沒有蛋白質和其他污染,適用于 RT-PCR、Real-Time RT-PCR、芯片分析、體外翻譯等實驗。

       

      注意事項

       

      1.  預防RNase污染,應注意以下幾方面:

      1)使用無RNase的塑料制品和槍頭,避免交叉污染。

       

      2)玻璃器皿應在使用前于180℃高溫下干烤4小時,塑料器皿可在0.5 M NaOH中浸泡10分鐘,用水徹底沖洗后高壓滅菌。

      3)配制溶液應使用無RNase的水。

       

      4)操作人員戴一次性口罩和手套,實驗過程中要勤換手套。

      2.  Buffer  RL 在使用前請加入β-巰基乙醇至終濃度為 1%,如 1 ml Buffer  RL 10 μl  β-巰基乙醇。加入β-巰基乙醇的

       

      Buffer RL 4℃可保存 1 個月,如出現沉淀,請加熱溶解后使用。

      3.  第一次使用前應按照試劑瓶標簽的說明先在 Buffer RW2 中加入無水乙醇。

      5.  如未特殊說明,所有離心步驟均在室溫下進行,且所有操作步驟動作要迅速。

       

      自備試劑:LysozymeYJ0887)、β-巰基乙醇、無水乙醇(新開封或提取RNA專用)  

       

       

      操作步驟

       

       1.   4℃  10,000 rpm~13,400×g)離心2分鐘收集菌體(菌體量最大不超過1×109 ),小心去除所有上清。

                                                                                      

           注意:上清如果有殘留,會影響后續的消化過程。

       

       2.   用含有Lysozyme100  μl TE緩沖液徹底重懸菌體,室溫孵育。具體配方和孵育時間如下:

       

      TE 緩沖液中 Lysozyme 的終濃度                孵育時間

       

      G 細菌                  400  μg/ml                 3-5 分鐘

                                -

      G+ 細菌                 3 mg/ml                   5-10 分鐘

       3.   加入350  μl裂解液RL(使用前請檢查是否加入β-巰基乙醇),渦旋震蕩混勻(此步驟可能出現不溶性沉淀),將溶液與沉淀全部加入到已裝入收集管(Collection Tube 2 ml)的過濾柱(Shredder Spin Column)中,10,000 rpm離心 2分鐘。

       4.   向上步得到的濾液中加入250  μl無水乙醇,混勻(此時可能會出現沉淀)。將得到的溶液和沉淀一起轉入吸附柱(Spin Column RM)中(吸附柱已裝入2 ml收集管中),10,000 rpm離心1分鐘,棄掉廢液,將吸附柱重新放回收集管中。

       5.   向吸附柱中加入350  μl Buffer RW1,10,000 rpm離心1分鐘,棄廢液,將吸附柱重新放回收集管中。

       6.   配制DNase I  混合液:取52 μl RNase-Free Water,向其中加入8  μl 10×Reaction Buffer 20  μl DNase I1U/μl),混勻,  配制成終體積為80 μl的反應液。

       7.   向吸附柱中直接加入80 µl DNase I  混合液,20-30℃孵育15分鐘。

       8.   向吸附柱中加入350  μl Buffer RW1,10,000 rpm離心1分鐘,棄廢液,將吸附柱重新放回收集管中。

       9.   向吸附柱中加入500  μl Buffer RW2(使用前檢查是否加入無水乙醇), 10,000 rpm離心1分鐘,棄廢液。

       10. 重復步驟9。

       11. 將吸附柱放回收集管中,10,000 rpm離心2分鐘。

           注意:這一步的目的是將吸附柱中殘余乙醇去除,乙醇殘留會影響后續的酶促反應(酶切、PCR)。

       12. 將吸附柱裝入新的RNase-Free1.5 ml  收集管中,向吸附膜的中間加入30-50 μl RNase-Free Water,室溫放置1分鐘,10,000 rpm離心1分鐘,收集RNA溶液,-70℃保存RNA,防止降解。

      注意:1)  RNase-Free Water 體積不應小于 30 μl,體積過小影響回收率。

      2)  如果要提高RNA的產量,可用30-50 μl新的RNase-Free Water重復步驟12。

      3)  如果要提高RNA濃度,可將得到的溶液重新加入到吸附柱中,重復步驟12。

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